?；D(zhuǎn)移酶（alcohol acyl transferase，AAT）活性測定試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

?；D(zhuǎn)移酶活性測定試劑盒 脂肪酸系列

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

AAT 是一個多功能蛋白大家族，主要負責催化生物體內(nèi)各種酰基化和去?；磻?yīng)，在基因表達、代謝和信號傳導(dǎo)中具有重要作用。

測定原理：

AAT 催化乙酰CoA 轉(zhuǎn)移乙?；蕉〈迹尫诺?CoA 還原DTNB 生成TNB；TNB 在 412nm 有吸收峰，測定 412 nm 吸光度增加速率可計算 AAT 活性。

組成：

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺式離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板、恒溫水浴鍋、無水乙醇。

粗酶液提?。?/span>

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。

細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。

液體：直接檢測。

AAT 測定操作：

1、分光光度計/酶標儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長到 412 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液的配制：臨用前在試劑二瓶中加入 18ml 試劑一，充分混勻待用。用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

3、試劑三的配制：臨用前加無水乙醇 1ml 充分溶解待用，用不完的試劑 4℃保存。

4、 空白管：在Ep 管或 96 孔板中加入 10μL 提取液和 180μL 工作液，充分混勻，35℃反應(yīng) 15min，加入10μL 試劑三，充分混勻，25℃靜置 10min，測定 412nm 處吸光值，記為 A 空白管。

5、 測定管：在 Ep 管或 96 孔板中加入 10μL 樣本和 180μL 工作液，充分混勻，35℃反應(yīng) 15min，加入 10μL試劑三，充分混勻，25℃靜置 10min，測定 412nm 處吸光值，記為A 測定管。△A=A 測定管- A 空白管，空白管只要做一管。

AAT 活性計算：

使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

按照蛋白濃度計算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 定義為一個酶活單位。

AAT (nmol/min/mg prot) = △A ÷（?×d）×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T = 98.04×△A÷Cpr

按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 定義為一個酶活單位。

AAT (nmol/min /g 鮮重) = △A ÷（?×d）×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T

= 98.04×△A÷W

按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：每 104 個細胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 定義為一個酶活單位。

AAT (nmol/min/104cell) = △A ÷（?×d）×V 反總÷(細胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總) ÷T

= 98.04×△A÷ 細胞數(shù)量

按液體體積計算

活性單位定義：每毫升樣品每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 定義為一個酶活單位。

AAT (nmol/min/ml) = △A ÷（?×d）×V 反總÷V 樣÷T

= 98.04×△A

?：TNB 消光系數(shù)，13600L/mol/cm；d：比色皿光徑：1cm；V 反總：反應(yīng)總體積，0.2ml；V 樣：加入反 應(yīng)體系中上清液體積，0.01ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：蛋白含量，mg/ml；W：樣本質(zhì)量， g；T：反應(yīng)時間，15 min。

使用 96 孔板測定的計算公式如下

按照蛋白濃度計算

活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 定義為一個酶活單位。

AAT (nmol/min/mg prot) = △A ÷（?×d）×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T

=196.08×△A÷Cpr

按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 定義為一個酶活單位。

AAT (nmol/min /g 鮮重) = △A ÷（?×d）×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T

= 196.08×△A÷W

按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：每 104 個細胞每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 定義為一個酶活單位。

AAT (nmol/min/104cell) = △A ÷（?×d）×V 反總÷(細胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總) ÷T

=196.08×△A÷ 細胞數(shù)量

按液體體積計算

活性單位定義：每毫升樣品每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol TNB 定義為一個酶活單位。

AAT (nmol/min/ml) = △A ÷（?×d）×V 反總÷V 樣÷T

= 196.08×△A

?：TNB 消光系數(shù)，13600L/mol/cm；d：96 孔板光徑：0.5cm；V 反總：反應(yīng)總體積，0.2ml；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.01ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：蛋白含量，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，15min。

酰基轉(zhuǎn)移酶活性測定試劑盒 脂肪酸系列