丙酮酸脫羧酶（PDC）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100T/96S

丙酮酸脫羧酶PDC活性測(cè)定試劑盒 脂肪酸系列

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

PDC 主要存在于酵母中，是乙醇發(fā)酵的關(guān)鍵酶之一，催化丙酮酸脫羧生成乙醛。

測(cè)定原理：

PDC 催化丙酮酸脫羧生成乙醛，添加乙醇脫氫酶（ADH）來(lái)進(jìn)一步催化 NADH 還原乙醛生成乙醇和NAD⁺；NADH 在 340 nm 有吸收峰，而 NAD⁺沒(méi)有；通過(guò)測(cè)定 340 nm 光吸收下降速率，來(lái)計(jì)算 PDC 活性。

組成：

混合試劑：臨用前配制，將試劑四和試劑五轉(zhuǎn)移至試劑三中充分溶解待用，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、可調(diào)式移液槍

粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌或細(xì)胞處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每 200 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 400μl提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率 200W，工作 3s，間歇 10s，工作 35 次），16000g 4℃離心 20min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織處理：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿，16000g 4℃離心 20min，取上清，置冰上待測(cè)。 3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

PDC 測(cè)定操作：

分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 340 nm，蒸餾水調(diào)零。

試劑二置于 25℃水浴中預(yù)熱 30min。

空白管：依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μl 蒸餾水、20μl 混合試劑、140μl 試劑二和 20μl 試劑六，迅速混勻后于 340nm 比色，記錄 15s 和 75s 的吸光值，分別記為A1 和A2。

測(cè)定管：依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μl 上清液、20μl 混合試劑、140μl 試劑二和 20μl 試劑

六，迅速混勻后于 340nm 比色，記錄 15s 和 75s 的吸光值，分別記為A3 和A4。

注意：空白管只需測(cè)定一次。

PDC 活性計(jì)算：

使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃中，每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol NADH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。

PDC (nmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×109}÷(Cpr×V 樣) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中，每克組織每分鐘催化 1nmol NADH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。

PDC (nmol/min /g 鮮重) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×109}÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中，每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化 1nmol NADH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。

PDC (nmol/min/104cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×109}÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總) ÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷細(xì)胞數(shù)量

按血清（漿）體積計(jì)算

活性單位定義：25℃中，每毫升血清（漿）每分鐘催化 1nmol NADH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。PDC (nmol/min

/ml) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×109}÷V 樣÷T

=1608×[(A3－A4)－(A1-A2)]

ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 總：反應(yīng)體系總體積，0.2ml=2×10-4 L，V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.02ml；V 樣總：提取液體積，1 ml；Cpr：蛋白濃度（mg/ml），需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA 蛋白質(zhì)含量試劑盒；W ：樣品質(zhì)量； T：反應(yīng)時(shí)間，1 min。

使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃中，每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol NADH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。

PDC (nmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×109}÷(Cpr×V 樣) ÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中，每克組織每分鐘催化 1nmol NADH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。

PDC (nmol/min /g 鮮重) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×109}÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中，每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化 1nmol NADH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。

PDC (nmol/min/104cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×109}÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總) ÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷細(xì)胞數(shù)量

按血清（漿）體積計(jì)算

活性單位定義：25℃中，每毫升血清（漿）每分鐘催化 1nmol NADH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。PDC (nmol/min

/ml) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×109}÷V 樣÷T

=3215×[(A3－A4)－(A1-A2)]

ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5 cm；V 總：反應(yīng)體系總體積，0.2ml=2×10-4 L，V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.02ml；V 樣總：提取液體積，1 ml；Cpr：蛋白濃度（mg/ml），需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA 蛋白質(zhì)含量試劑盒；W ：樣品質(zhì)量； T：反應(yīng)時(shí)間，1 min。

丙酮酸脫羧酶PDC活性測(cè)定試劑盒 脂肪酸系列