ELISA試劑盒標本采集的注意事項

ELISA實驗標本的采集、處理和保存

 能夠應(yīng)用ELISA 實驗的樣本種類很多，有血清，血漿，細胞上清，細胞裂解液，尿液，關(guān)節(jié)滑液，腦脊液，肺泡灌洗液，各種組織的組織勻漿；采集和處理的方式都不相同。下面就列出了 收集的給類樣本的采集、處理和保存方式。方法大多出自文獻和試劑盒說明書，部分方法驗證過，但有的方法并沒有實際操作過，所以，以下方法僅供參考。

 一、ELISA實驗中血清的采集、處理和保存；

1、 真空采血針采集2ml新鮮血液，加入無菌試管中；

2、 采血后室溫靜置1小時；

3、 將采集血液用離心機4℃，2500rpm離心10min，，將離心好的勻漿留上清，棄下面沉淀。

4、 取上清。 分裝凍存?zhèn)溆茫?/span>

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-70℃下，可放置保存6個月；

5、 根據(jù)你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA測定。 

大部分ELISA檢測均以血清為標本。血清標本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標記的 ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。此外還應(yīng)避免細菌污染，因為菌體中可能含有含有內(nèi)源性HRP，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。血清標本宜在新鮮 時檢測。如在冰箱中保存過久，其中的可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。

 二、ELISA實驗中血漿的采集、處理和保存；

1、 真空采血針采集2ml新鮮血液，加入無菌試管中；

2、 按1:9加入抗凝劑（EDTA、草酸鈉、肝素、枸櫞酸鈉），30分鐘內(nèi)于冰上分離血漿以減少血小板的污染；（也可以直接用抗凝管采集）；

3、 將采集血液用離心機4℃，2500rpm離心5min，，將離心好的勻漿留上清，棄下面沉淀。

4、 取上清。 分裝凍存?zhèn)溆茫?/span>

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-70℃下，可放置保存6個月；

5、 根據(jù)你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA測定。 請注意指標說明書上對于抗凝血劑是否有特殊要求，建議使用EDTA。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。

注意事項：制備血漿標本需借助于抗凝劑EDTA,抗凝不*的標本因纖維蛋白原干擾而造成假陽性。

 三、ELISA 實驗中尿液的采集、處理和保存；

1、 采集尿液樣本500ul，加入無菌試管中；

2、 將采集血液用離心機4℃，2500rpm離心10min，，將離心好的樣本留上清，棄下面沉淀。

3、 取上清。 分裝凍存?zhèn)溆茫?/span>

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-70℃下，可放置保存6個月；

4、 根據(jù)你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA測定。

 四、ELISA 實驗中腦脊液的采集、處理和保存；

1、采集腦脊液樣本，加入無菌試管中；

2、將采集血液用離心機4℃，2500rpm離心10min，，將離心好的樣本留上清，棄下面沉淀。

3、取上清。 分裝凍存?zhèn)溆茫?/span>

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-70℃下，可放置保存6個月；

4、根據(jù)你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA測定。

 五、ELISA 實驗中細胞上清液的采集、處理和保存；

1、采集細胞培養(yǎng)上清液500ul，加入無菌試管中；

2、將采集血液用離心機4℃，2500rpm離心10min，，將離心好的勻漿留上清，棄下面沉淀。

3、取上清。 分裝凍存?zhèn)溆茫?/span>

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-70℃下，可放置保存6個月；

4、根據(jù)你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA測定。

 六、ELISA 實驗中細胞裂解液的采集、處理和保存；（需要測蛋白濃度）

1、 取細胞培養(yǎng)板或細胞懸液，用PBS（PH7.2-7.4）洗滌細胞培養(yǎng)板1-2次。

2、 通過反復(fù)凍融或加入組織蛋白萃取試劑（裂解液），使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。

3、 將采集血液用離心機4℃，2500rpm離心20min，，將離心好的勻漿留上清，棄下面沉淀。

4、 取上清。 分裝凍存?zhèn)溆茫?/span>

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-70℃下，可放置保存6個月；

5、 根據(jù)你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA測定。

 七、ELISA 實驗中肺泡灌洗液的采集、處理和保存；

1、 10%水合氯醛溶液，腹腔麻醉。

2、 打開腹腔，另取10ml注射器行下腔靜脈采血，盡可能將血放盡。

3、 在冰面上對左肺進行肺灌洗。取37℃生理鹽水5ml，分三次灌洗：2ml、1.5ml、1.5ml灌洗?；厥章试?0%以上。

4、 將肺泡灌洗液用離心機4℃，1500rpm離心10min。

5、 取上清。 分裝凍存?zhèn)溆茫?/span>

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-70℃下，可放置保存6個月；

6、 根據(jù)你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA測定。

 八、ELISA 實驗中關(guān)節(jié)滑液的采集、處理和保存；

1、 口腔關(guān)節(jié)：患者取坐位，常規(guī)消毒后，作皮下及關(guān)節(jié)后區(qū)局部浸潤麻醉。然后囑患者大張口，采用裝有2ml生理鹽水的注射器（5號針頭）作關(guān)節(jié)上腔 穿刺，髁后進針，針尖方向斜向前、內(nèi)、上，抵達關(guān)節(jié)結(jié)節(jié)后斜面后稍后退，回抽如發(fā)現(xiàn)有淡黃色液體，即表明已進入關(guān)節(jié)上腔，注入2ml生理鹽水，反復(fù)注入、 回抽五次。

   膝骨關(guān)節(jié)滑液：無菌穿刺取得關(guān)節(jié)液。

2、 將關(guān)節(jié)液用離心機4℃，1500rpm離心15min，將離心好的勻漿留上清，棄下面沉淀。

3、 取上清。 分裝凍存?zhèn)溆茫?/span>

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-70℃下，可放置保存6個月；

4、 根據(jù)你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA測定。

 九、 ELISA實驗中各類組織勻漿（容易勻漿的組織）的采集、處理和保存；（需要測蛋白濃度）

1、 采集組織，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，剔除附屬的結(jié)締組織，稱取組織塊。

2、 用移液管量取0.1M PBS或者用0.86％冷生理鹽水，勻漿介質(zhì)或生理鹽水的體積總量應(yīng)該是組織塊重量的9倍，用眼科小剪盡快剪碎組織塊（天然時操作要在冰水浴中進行，將盛有組織 的小燒杯放入冰水中）。

3、 勻漿的方式有多種： 

a) 手工勻漿：將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，再將剩余的1/3勻漿介質(zhì)或生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿管中進行勻漿，左手持勻漿管將下 端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動研磨數(shù)十次（6～8分鐘），充分研碎，使組織勻漿化。

b) 機器勻漿：用組織搗碎機10000～15000r/min上下研磨制成10％組織勻漿，也可用內(nèi)切式組織勻漿機制備（勻漿時間10秒/次，間隙30秒，連續(xù)3～5次，在冰水中進行），皮膚、肌肉組織等可延長勻漿時間。

4、 將制備好的10％勻漿用離心機4℃，3000rpm離心15min，將離心好的勻漿留上清，棄下面沉淀。

5、 取上清。 分裝凍存?zhèn)溆茫?/span>

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-70℃下，可放置保存6個月；

6、 根據(jù)你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA測定。

 十、ELISA實驗中各類組織勻漿（不易勻漿的組織）的采集、處理和保存；（需要測蛋白濃度）

7、 采集組織，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，剔除附屬的結(jié)締組織，稱取組織塊。

8、 用移液管量取0.1M PBS或者用0.86％冷生理鹽水，勻漿介質(zhì)或生理鹽水的體積總量應(yīng)該是組織塊重量的9倍，用眼科小剪盡快剪碎組織塊（天然時操作要在冰水浴中進行，將盛有組織 的小燒杯放入冰水中）。

9、 勻漿的方式有多種： 

a) 手工勻漿：將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，再將剩余的1/3勻漿介質(zhì)或生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿管中進行勻漿，左手持勻漿管將下 端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動研磨數(shù)十次（6～8分鐘），充分研碎，使組織勻漿化。

b) 機器勻漿：用組織搗碎機10000～15000r/min上下研磨制成10％組織勻漿，也可用內(nèi)切式組織勻漿機制備（勻漿時間10秒/次，間隙30秒，連續(xù)3～5次，在冰水中進行），皮膚、肌肉組織等可延長勻漿時間。

c) 超聲粉碎：用超聲粉碎機進行粉碎，可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎，也可用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀，用40安培，5秒/次，間隙10秒反復(fù)3～5次。

10、 將制備好的10％勻漿用離心機4℃，3000rpm離心15min，將離心好的勻漿留上清，棄下面沉淀。

11、 取上清。 分裝凍存?zhèn)溆茫?/span>

2-8℃下，可放置保存24-48小時；

-20℃下，可放置保存1個月；

-70℃下，可放置保存6個月；

12、 根據(jù)你的實驗需要，取適量上清夜進行各種ELISA測定。