人總膠原蛋白（Collagen）ELISA試劑盒使用說明
 (用于血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清液和其它生物體液內)
 
原理
本實驗采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗人 Collagen I 單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的 Collagen I與單抗結合，加入生物素化的抗人Collagen I，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入底物工作液顯藍色，后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，Collagen I濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中Collagen I濃度。
試劑盒組成（2-8℃保存）
酶標板（Coated Wells）
96孔
酶標抗體工作液（Enzyme Conjugate）
12ml
10×標本稀釋液（Sample Buffer）
12ml
20×濃縮洗滌液（Wash Buffer）
50ml
標準品（Standards）：1000ng/ml
1瓶
底物工作液（TMB Solution）
12ml
di一抗體工作液（Biotinylated Antibody）
12ml
終止液（Stop Solution）
12ml
準備試劑與收集血樣
1.          收集標本：血清、血漿（EDTA、檸檬酸鹽、肝素抗凝）、細胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反復凍融。
2.          標準品液配制：設標準管7管，每管加入標本稀釋液300ul。在di一管中加入1000ng/ml的標準品溶液300ul混勻后用加樣器吸出300ul，移至第二管。如此反復作對倍稀釋，從第六管中吸出300ul棄去。第七管為空白對照。加上原液管總共八管。
3.          10×標本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。
4.         洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）
檢測程序
1.          加樣：每孔各加入標準品或待測樣品100ul，將反應板充分混勻后置37℃120分鐘。
2.          洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。
3.          每孔中加入di一抗體工作液100ul。將反應板充分混勻后置37℃60分鐘。
4.          洗板：同前。
5.          每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應板置37℃30分鐘。
6.          洗板：同前。
7.          每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應15分鐘。
8.          每孔加入100ul終止液混勻。
9.          30分鐘內用酶標儀在450nm處測吸光值。
結果計算與判斷
1.          所有OD值都應減除空白值后再行計算。
2.          以標準品1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、0 ng/ml為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線。
3.          根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應Collagen I含量。
試劑盒性能
             1.   靈敏度：小的Collagen I 檢測濃度小于10ng/ml。
2.        特異性：可同時檢測重組或天然的人Collagen I。不與人其它細胞因子有交叉反應。
3.        重復性：板內、板見變異系數(shù)均小于10％。
注意事項
             1.   以上標準孔及待測樣品均建議做復孔，每次測定應同時做標準曲線。
 2.   洗滌過程很關鍵。洗滌不充分將導致精確度誤差及OD值錯誤地升高。
             3.   板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。
             4.   本試劑盒宜置4oC冰箱保存。
 5.   本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！