A172人膠質(zhì)母細胞瘤細胞

規(guī)格：70%密度的25cm2培養(yǎng)瓶的細胞一瓶
特點：細胞代數(shù)為4代以內(nèi)
包裝：內(nèi)層無菌自封袋；防壓泡沫盒；外層防壓保溫氣泡袋；說明書
細胞來源：ATCC、sciencell、ICLC
貨期：1-2周
運輸方式：快遞運輸
售后：收到細胞后12天，如發(fā)現(xiàn)細胞有質(zhì)量問題（如污染，死亡，快遞運輸?shù)仍颍r，應(yīng)出具書面質(zhì)量問題報告并及時傳真或致銷售人員，我們將盡快為您解決！

上海琛藝實業(yè)與您攜手共進！

A172-GFP人膠質(zhì)母細胞瘤細胞-綠色標(biāo)記  已通過STR鑒定

以下細胞處理方法及細胞說明書僅供參考，具體操作還需要根據(jù)到貨時細胞密度，細胞生長狀態(tài)等具體情況，酌情處理，如需要更詳細技術(shù)指導(dǎo)，請及時或郵件。
需要特別指出的是：如細胞出現(xiàn)問題，請于48h內(nèi)及時反饋，本公司將竭誠為您服務(wù)！
一．貼壁細胞  
客戶接收到細胞，用75%的酒精消毒（建議配制75%酒精的水是滅菌過的）培養(yǎng)瓶外部。
肉眼觀察細胞培養(yǎng)基顏色，顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數(shù)拍照（建議收到時的培養(yǎng)瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時的細胞100X ,200X 各一張）。
顯微鏡觀察細胞，當(dāng)細胞融匯至80%左右（可以傳代的情況下），細胞應(yīng)該在37度培養(yǎng)箱預(yù)溫1-2h后再做處理。如未達到細胞傳代密度，培養(yǎng)瓶應(yīng)預(yù)留一部分培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
嚴格無菌操作，打開細胞培養(yǎng)瓶。
將細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基用吸管*吸出（嚴禁直接傾倒），放入另一無菌容器中（建議換新的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞）。
用PBS 2-3ml/次輕輕洗細胞表面，加入適量的0.05%胰酶-EDTA消化細胞,顯微鏡下觀察細胞變圓，輕輕拍打培養(yǎng)瓶直到細胞脫落，加入終止液終止。 
1000rpm,5min離心，重懸細胞。換新的細胞培養(yǎng)瓶，37℃,5%CO2  培養(yǎng)。 
二．懸浮細胞 
1. 接收到細胞，用75%的酒精消毒（建議配制75%酒精的水是滅菌過的）培養(yǎng)瓶外部。
2. 肉眼觀察細胞培養(yǎng)基顏色，顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數(shù)拍照（建議收到時的培養(yǎng)瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時的細胞100X ,200X 各一張）。
3. 嚴格無菌操作，打開細胞培養(yǎng)瓶。
4. 將細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基用吸管*吸出（嚴禁直接傾倒）。
5. 1000rpm,5min離心，重懸細胞。 換新的細胞培養(yǎng)瓶和新鮮培養(yǎng)基，37℃,5%CO2  培養(yǎng)。
三．一毫升小管操作方法  小管內(nèi)也是此細胞。 
1. 用75%的酒精消毒（建議配制75%酒精的水是滅菌過的）。
2. 嚴格無菌操作，用吸管吸出管中細胞至9ml*培養(yǎng)基混勻。
3. 1000rpm,5min離心，重懸細胞。 
4.換新的細胞培養(yǎng)瓶，37℃,5%CO2  培養(yǎng)。

?細胞名稱   A172-GFP人膠質(zhì)母細胞瘤細胞-綠色標(biāo)記  已通過STR鑒定
?轉(zhuǎn)染方法與標(biāo)記過程的描述 慢病毒轉(zhuǎn)染Hygromycin篩選 
1.質(zhì)粒部分
1.酶切載體：pGL4.10（luc2）由酶切獲得1400bp的luc2基因片斷；EGFP和mCherry片段由PCR擴增獲得700-800bp左右片段；pSin-hyg-T2A載體酶切線性化。
2.電泳和膠回收：上述酶切產(chǎn)物DNA電泳，TAKARA試劑盒膠回收，回收產(chǎn)物取少量電泳鑒定。
3.連接載體與目的片段:使用Invitrogen T4連接酶連接luc2、EGFP或mCherry片段和pSin-hyg-T2A線性化載體，連接使用20ul體系，25℃，10min。
4.轉(zhuǎn)化：感受態(tài)菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入連接產(chǎn)物，靜置25min后在水浴42℃，45sec熱休克，后加入250ul無抗培養(yǎng)基225轉(zhuǎn)搖菌1h，將轉(zhuǎn)化的菌鋪于有氨芐抗性平板37度過夜。
5.挑取單克?。河^察平板后挑取15個單克隆至含2ml氨芐抗性 LB培養(yǎng)基搖菌管中，255轉(zhuǎn)搖菌6.5h。
6.小抽質(zhì)粒與鑒定：使用堿裂解法小抽，質(zhì)粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鑒定: 重組質(zhì)粒用通過酶切鑒定。
7.熒光素表達鑒定: 重組質(zhì)粒pSin-hyg-GFP/luc2（以下簡稱Gluc）或pSin-hyg-mCherry/luc2（以下簡稱Mluc） 轉(zhuǎn)染293T細胞：DNA定量后，使用PEI轉(zhuǎn)染Gluc或Mluc至24孔板已預(yù)鋪的293T細胞中。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，試劑采用JetPEI (Polyplus公司)。兩管EP管中分別加入50ul生理鹽水，其中一管加入1ug量的質(zhì)粒（DNA體積=1ug/DNA濃度），輕輕震蕩混勻，再輕微離心；在另一管中加入PEI 2ul輕輕震蕩混勻，輕微離心，然后把PEI管中的溶液加入含有的質(zhì)粒管中，室溫孵育20min。將脂質(zhì)體包繞DNA的混合液加入需要轉(zhuǎn)染的24孔內(nèi)，37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)，8小時后換培養(yǎng)液。
8.報告基因檢測：Passive Lysis Agent裂解細胞，加入熒光素酶作用底物，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞與陰性，陽性對照共同進行單報告基因檢測。
9.質(zhì)粒中抽：取1ml轉(zhuǎn)染報告基因檢測正確的菌液加入100ml氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中搖菌過夜，使用Invitrogen試劑盒中抽，產(chǎn)物電泳鑒定，－20℃保存。
1.慢病毒包裝部分
1. 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細胞：轉(zhuǎn)染前一天，293T在10cm培養(yǎng)盤中的細胞達到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養(yǎng)盤中。轉(zhuǎn)染時，細胞在培養(yǎng)盤中密度達到80％。采用脂質(zhì)體PEI轉(zhuǎn)染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質(zhì)粒VSV G, Packaging Mix以及構(gòu)建的Gluc或Mluc質(zhì)粒15µg共轉(zhuǎn)染。6h后換新鮮DMEM培養(yǎng)基。
2．提取病毒上清：轉(zhuǎn)染48-72hours后，將含有病毒液的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細胞碎片。
3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500µl離心管中，-80℃保存。