?細(xì)胞名稱   NCI-H460-LUC人大細(xì)胞肺癌熒光素酶標(biāo)記細(xì)胞 培養(yǎng)步驟
?組織:人大細(xì)胞系
?母細(xì)胞來(lái)源  客戶
?轉(zhuǎn)染方法與標(biāo)記過(guò)程的描述 慢病毒轉(zhuǎn)染Hygromycin篩選 
1.質(zhì)粒部分
1.酶切載體：pGL4.10（luc2）由酶切獲得1400bp的luc2基因片斷；EGFP和mCherry片段由PCR擴(kuò)增獲得700-800bp左右片段；pSin-hyg-T2A載體酶切線性化。
2.電泳和膠回收：上述酶切產(chǎn)物DNA電泳，TAKARA試劑盒膠回收，回收產(chǎn)物取少量電泳鑒定。
3.連接載體與目的片段:使用Invitrogen T4連接酶連接luc2、EGFP或mCherry片段和pSin-hyg-T2A線性化載體，連接使用20ul體系，25℃，10min。
4.轉(zhuǎn)化：感受態(tài)菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入連接產(chǎn)物，靜置25min后在水浴42℃，45sec熱休克，后加入250ul無(wú)抗培養(yǎng)基225轉(zhuǎn)搖菌1h，將轉(zhuǎn)化的菌鋪于有氨芐抗性平板37度過(guò)夜。
5.挑取單克?。河^察平板后挑取15個(gè)單克隆至含2ml氨芐抗性 LB培養(yǎng)基搖菌管中，255轉(zhuǎn)搖菌6.5h。
6.小抽質(zhì)粒與鑒定：使用堿裂解法小抽，質(zhì)粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鑒定: 重組質(zhì)粒用通過(guò)酶切鑒定。
7.熒光素表達(dá)鑒定: 重組質(zhì)粒pSin-hyg-GFP/luc2（以下簡(jiǎn)稱Gluc）或pSin-hyg-mCherry/luc2（以下簡(jiǎn)稱Mluc） 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞：DNA定量后，使用PEI轉(zhuǎn)染Gluc或Mluc至24孔板已預(yù)鋪的293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，試劑采用JetPEI (Polyplus公司)。兩管EP管中分別加入50ul生理鹽水，其中一管加入1ug量的質(zhì)粒（DNA體積=1ug/DNA濃度），輕輕震蕩混勻，再輕微離心；在另一管中加入PEI 2ul輕輕震蕩混勻，輕微離心，然后把PEI管中的溶液加入含有的質(zhì)粒管中，室溫孵育20min。將脂質(zhì)體包繞DNA的混合液加入需要轉(zhuǎn)染的24孔內(nèi)，37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)，8小時(shí)后換培養(yǎng)液。
8.報(bào)告基因檢測(cè)：Passive Lysis Agent裂解細(xì)胞，加入熒光素酶作用底物，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞與陰性，陽(yáng)性對(duì)照共同進(jìn)行單報(bào)告基因檢測(cè)。
9.質(zhì)粒中抽：取1ml轉(zhuǎn)染報(bào)告基因檢測(cè)正確的菌液加入100ml氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中搖菌過(guò)夜，使用Invitrogen試劑盒中抽，產(chǎn)物電泳鑒定，－20℃保存。

NCI-H460-LUC人大細(xì)胞肺癌熒光素酶標(biāo)記細(xì)胞 培養(yǎng)步驟
1.慢病毒包裝部分
1. 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天，293T在10cm培養(yǎng)盤(pán)中的細(xì)胞達(dá)到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養(yǎng)盤(pán)中。轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞在培養(yǎng)盤(pán)中密度達(dá)到80％。采用脂質(zhì)體PEI轉(zhuǎn)染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質(zhì)粒VSV G, Packaging Mix以及構(gòu)建的Gluc或Mluc質(zhì)粒15µg共轉(zhuǎn)染。6h后換新鮮DMEM培養(yǎng)基。
2．提取病毒上清：轉(zhuǎn)染48-72hours后，將含有病毒液的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細(xì)胞碎片。
3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過(guò)濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500µl離心管中，-80℃保存。
1.慢病毒感染&篩選
1.感染前一天(Day1)，消化4T1細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞鋪于24孔板中（以便在感染前細(xì)胞達(dá)到30%-50%的匯合度，37°C過(guò)夜孵化細(xì)胞。
2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液，并且制備1：2病毒稀釋液200µl加入細(xì)胞中。
3.向每孔加入Polybrene達(dá)到終濃度6ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過(guò)夜。
4.(Day3)移去含有慢病毒的培養(yǎng)基，加入500µl*培養(yǎng)基。
5.(Day4)換液，加入300µg/ml  Hygromycin（Sigma）來(lái)選擇穩(wěn)定感染的細(xì)胞克隆。
6.(Day4－7），每24h換液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）來(lái)選擇穩(wěn)定感染的細(xì)胞克隆。
維持培養(yǎng)。
7.(Day8－12）細(xì)胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤(pán)和10cm盤(pán)中100µg/ml Hygromycin維持培養(yǎng)。
8. 4T1-Gluc/Mluc細(xì)胞系鑒定: 取5×104細(xì)胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞與陰性，陽(yáng)性對(duì)照共同進(jìn)行單報(bào)告基因檢測(cè)。GFP和mCherry表達(dá)通過(guò)熒光顯微鏡觀察。
 
?培養(yǎng)條件 ：置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，用含10％胎牛血清（FBS;    Hyclone, Tauranga, New Zealand）和1％雙抗（100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml鏈霉素，Hyclone, Logan, UT, USA）的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)一天（密度大概80%）按照1：3的比例傳代。
?細(xì)胞傳代所需時(shí)間：1天/代 
?篩選標(biāo)記維持壓力和選擇壓力：Hygromycin 100ug/ml 和300ug/ml 。
"NCI-H460 [H460] Cell<人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系>
細(xì)胞形態(tài)特性：詳見(jiàn)細(xì)胞說(shuō)明書(shū)
778571-57-6
細(xì)胞生長(zhǎng)特性：貼壁
冷凍細(xì)胞解凍程序：依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、血清種類和其它之成份和比例，制備培養(yǎng)基。絕大多數(shù)之細(xì)胞均無(wú)法立即適應(yīng)不同之基礎(chǔ)培養(yǎng)基或不同之血清種類，若因?qū)嶒?yàn)需要，必須有所不同時(shí)，務(wù)必以緩慢比例漸次改變培養(yǎng)基組成，確定細(xì)胞適應(yīng)后，方進(jìn)行所需之實(shí)驗(yàn)。FBS(fetal bovine serum,胚牛血清), CS(calf serum,小牛血清)和HS(horse serum,馬血清)，對(duì)細(xì)胞而言差異極大，請(qǐng)務(wù)必依據(jù)細(xì)胞株資料單之血清種類培養(yǎng)之。將培養(yǎng)基置于３７°C水槽中回溫，回溫后噴以７０%酒精并擦拭之，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。取出冷凍管，立即放入３７°C水槽中快速解凍，水面高度不可接近或高過(guò)冷凍管之蓋沿，否則易發(fā)生污染。輕搖冷凍管使其在１分鐘內(nèi)全部融化后，以７０%ethanol擦拭冷凍管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。依據(jù)細(xì)胞種類和濃度，于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)取１０ml培養(yǎng)基加至T２５或T７５flask中。取出已解凍之細(xì)胞懸浮液，緩緩加入T２５或T７５flask內(nèi)之培養(yǎng)基，混合均勻，放入３７°C，５%CO２培養(yǎng)箱培養(yǎng)。對(duì)絕大多數(shù)細(xì)胞而言，１%以下之冷凍保護(hù)劑DMSO，不會(huì)對(duì)細(xì)胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細(xì)胞中去除，待第二天確定細(xì)胞生長(zhǎng)或貼附良好后再去除即可。惟對(duì)極少數(shù)因?qū)MSO敏感或會(huì)造成細(xì)胞分化之細(xì)胞，需立即去除DMSO者，則可將解凍后之細(xì)胞懸浮液放入５-１０ml培養(yǎng)基中，離心３００xg(約１０００rpm)，５分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞均勻混合后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，再放入３７°C，５%CO２培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
NCI-H460 [H460] Cell<人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞系>
細(xì)胞產(chǎn)品包裝：復(fù)蘇形式：T25培養(yǎng)瓶(一瓶)或凍存形式：1ml凍存管(兩支)
MDA-MB-175細(xì)胞系；細(xì)胞傳代方法：1：2—1：6傳代，每周換液2—3次；細(xì)胞形態(tài)特性：上皮細(xì)胞樣；細(xì)胞生長(zhǎng)特性：松散貼壁；細(xì)胞背景資料：該細(xì)胞源自一位54歲患有乳腺導(dǎo)管癌白人女性的胸腔積液。
HCT116[HCT116]細(xì)胞系；細(xì)胞傳代方法：1：2-1：3傳代；每周換液2-3次；細(xì)胞形態(tài)特性：詳見(jiàn)細(xì)胞說(shuō)明書(shū)；細(xì)胞生長(zhǎng)特性：貼壁或懸浮，詳見(jiàn)細(xì)胞說(shuō)明書(shū)部分；細(xì)胞背景資料：詳見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)介紹
COV434細(xì)胞系；細(xì)胞傳代方法：1：2傳代；細(xì)胞形態(tài)特性：上皮細(xì)胞；細(xì)胞生長(zhǎng)特性：貼壁生長(zhǎng)；細(xì)胞背景資料：詳見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)介紹
RC-4BC細(xì)胞系；細(xì)胞傳代方法：1：2-1：3傳代；每周換液2-3次；細(xì)胞形態(tài)特性：詳見(jiàn)細(xì)胞說(shuō)明書(shū)；細(xì)胞生長(zhǎng)特性：貼壁或懸浮，詳見(jiàn)細(xì)胞說(shuō)明書(shū)部分；細(xì)胞背景資料：詳見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)介紹
B16細(xì)胞系；細(xì)胞傳代方法：1：3傳代，2-3天換液一次；細(xì)胞形態(tài)特性：梭形；細(xì)胞生長(zhǎng)特性：貼壁生長(zhǎng)；細(xì)胞背景資料：該細(xì)胞源于C57BL/6J小鼠黑色素瘤，可以產(chǎn)生黑色素，同基因小鼠體內(nèi)移植可成瘤
MEF-11細(xì)胞系；細(xì)胞傳代方法：1：2-1：3傳代；每周換液2-3次；細(xì)胞形態(tài)特性：詳見(jiàn)細(xì)胞說(shuō)明書(shū)；細(xì)胞生長(zhǎng)特性：貼壁或懸浮，詳見(jiàn)細(xì)胞說(shuō)明書(shū)部分；細(xì)胞背景資料：詳見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)介紹
細(xì)胞來(lái)源說(shuō)明：細(xì)胞主要來(lái)源ATCC、DSMZ、ECACC、RIKEN、INCell、promocell、ScienCell、ECACC、JCRB、KCLB、Asterand、ICLC以及少數(shù)國(guó)外著名大學(xué)建系
細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌操作步驟和注意事項(xiàng)：１.打開(kāi)無(wú)菌工作臺(tái)及凈化室的紫外燈，消毒半小時(shí)以上。２.進(jìn)入凈化室前先關(guān)閉紫外燈，打開(kāi)超凈臺(tái)風(fēng)機(jī)，等待３０min以上，以排盡臭氧。３.穿好隔離衣，戴好口罩，帽子。４.風(fēng)淋２分鐘。５.０.１%水泡手，擦干。６.點(diǎn)燃酒精燈;超凈臺(tái)內(nèi)應(yīng)避免放入過(guò)多的物品;使用的吸管，滴管，試管，培養(yǎng)瓶等均事先滅菌。７.打開(kāi)各類瓶蓋前先過(guò)火，以固定灰塵;打開(kāi)的瓶口、試管口過(guò)火焰，鑷子使用前應(yīng)經(jīng)火焰燒灼。８.水平式風(fēng)機(jī)的超凈臺(tái)，應(yīng)使瓶口斜置，應(yīng)盡量避免瓶口敞開(kāi)直立。９.同一根吸管或滴管不應(yīng)連續(xù)用于幾個(gè)不同的細(xì)胞系；吸取培養(yǎng)基的吸管應(yīng)離開(kāi)培養(yǎng)瓶或試管口０.５cm，避免伸入培養(yǎng)瓶口或試管口；以防止細(xì)胞系的互相混雜污染。１０.漏在培養(yǎng)瓶上或臺(tái)上的液體，立即用酒精棉球擦凈。１１.操作完畢后恢復(fù)工作臺(tái)面。
?體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：
1.4T1-Gluc 和4T1-Mluc熒光顯微鏡照片(100×)：
2.細(xì)胞裂解液的發(fā)光值，數(shù)據(jù)—化學(xué)發(fā)光儀(Berthold Lumat LB 9501)檢測(cè)。