一、    細(xì)胞名稱   ：Saos-2-LUC人成骨肉瘤熒光素酶標(biāo)記細(xì)胞 處理步驟

二、    組織  人骨肉瘤細(xì)胞

三、    母細(xì)胞來源  ATCC

四、    轉(zhuǎn)染方法與標(biāo)記過程的描述 慢病毒轉(zhuǎn)染G418篩選 

(一)     質(zhì)粒部分

1.酶切載體：pGL3-SV40-luc使用NheⅠ和XBaⅠ內(nèi)切酶37度過夜酶切，切下為1400bp的luc基因片斷；同時(shí) plenti-neo使用speⅠ內(nèi)切酶37度過夜單酶切。

2.電泳和膠回收：plenti-neo切開后加CIAP去磷酸化，37℃，30min；將片段luc和載體plenti-neo進(jìn)行DNA電泳，再用TAKALA試劑盒膠回收，回收產(chǎn)物取少量電泳鑒定。

3.連接載體與目的片段:使用Invitrogen T4連接酶連接luc片段和plenti-neo線性化載體，連接使用20ul體系，25℃，10min。

4.轉(zhuǎn)化：感受態(tài)菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入連接產(chǎn)物，靜置25min后在水浴42℃，45sec熱休克，后加入250ul無抗培養(yǎng)基225轉(zhuǎn)搖菌1h，將轉(zhuǎn)化的菌鋪于有氨芐抗性平板37度過夜。

5.挑取單克?。河^察平板后挑取15個(gè)單克隆至含2ml氨芐抗性 LB培養(yǎng)基搖菌管中，255轉(zhuǎn)搖菌6.5h。

6.小抽質(zhì)粒與鑒定：使用堿裂解法小抽，質(zhì)粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鑒定: 重組質(zhì)粒用SpeⅠ內(nèi)切酶37℃，2h單切，由于目的基因插入后speⅠ酶切位點(diǎn)發(fā)生融合，故不能切開者可鑒定為構(gòu)建成功的質(zhì)粒。

7.熒光素表達(dá)鑒定: 重組質(zhì)粒plenti-neo-luc 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞：DNA定量后，使用PEI轉(zhuǎn)染plenti-neo-luc至24孔板已預(yù)鋪的293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，試劑采用JetPEI (Polyplus公司)。兩管EP管中分別加入50ul生理鹽水，其中一管加入1ug量的質(zhì)粒plenti-neo-luc（DNA體積=1ug/DNA濃度），輕輕震蕩混勻，再輕微離心；在另一管中加入PEI 2ul輕輕震蕩混勻，輕微離心，然后把PEI管中的溶液加入含有的質(zhì)粒管中，室溫孵育20min。將脂質(zhì)體包繞DNA的混合液加入需要轉(zhuǎn)染的24孔內(nèi)，37 ℃、5 % CO2條件下培養(yǎng)，8小時(shí)后換培養(yǎng)液。

8.報(bào)告基因檢測(cè)：Passive Lysis Agent裂解細(xì)胞，加入熒光素酶作用底物，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞與陰性，陽性對(duì)照共同進(jìn)行單報(bào)告基因檢測(cè)。

9.質(zhì)粒中抽：取1ml轉(zhuǎn)染報(bào)告基因檢測(cè)正確的菌液加入100ml氨芐抗性的LB培養(yǎng)基中搖菌過夜，使用Invitrogen試劑盒中抽，產(chǎn)物電泳鑒定，－20℃保存。

(二)  Saos-2-LUC人成骨肉瘤熒光素酶標(biāo)記細(xì)胞 處理步驟

   慢病毒包裝部分

1. 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天， 293T在10cm培養(yǎng)盤中的細(xì)胞達(dá)到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養(yǎng)盤中。轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞在培養(yǎng)盤中密度達(dá)到80％。采用脂質(zhì)體PEI轉(zhuǎn)染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質(zhì)粒VSV G, Packaging Mix以及構(gòu)建的plenti-neo-luc質(zhì)粒15μg共轉(zhuǎn)染。6h后換新鮮DMEM培養(yǎng)基。

2．提取病毒上清：轉(zhuǎn)染48-72hours后，將含有病毒液的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細(xì)胞碎片。

3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500μl離心管中，-80℃保存。

(三)     慢病毒感染&篩選

1.感染前一天(Day1)，消化Soas2細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞鋪于24孔板中（以便在感染前細(xì)胞達(dá)到30%-50%的匯合度，37°C過夜孵化細(xì)胞。

2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液，并且制備1：2病毒稀釋液200μl加入細(xì)胞中。

3.向每孔加入Polybrene達(dá)到終濃度6ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過夜。

4.(Day3)移去含有慢病毒的培養(yǎng)基，加入500μl*培養(yǎng)基。

5.(Day4)換液，加入500μg/ml  G418來選擇穩(wěn)定感染的細(xì)胞克隆。

6.(Day4－7），每24h換液，500μg/mlG418維持培養(yǎng)。

7.(Day8－12）細(xì)胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤和10cm盤中500μg/mlG418維持培養(yǎng)。

8. Soas2-luc細(xì)胞系鑒定: 取5×104細(xì)胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞與陰性，陽性對(duì)照共同進(jìn)行單報(bào)告基因檢測(cè)。

五、    培養(yǎng)條件 ：置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，用含10％胎牛血清（FBS;    Hyclone, Tauranga, New Zealand）和1％雙抗（100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml鏈霉素，Hyclone, Logan, UT, USA）的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)三天（密度大概80%）按照1：3的比例傳代。

【注意事項(xiàng)】有專家感覺用αMEM培養(yǎng)基效果更好。

六、    細(xì)胞傳代所需時(shí)間：3天/代 

七、    篩選標(biāo)記維持壓力和選擇壓力：G418 200ug/ml 和500ug/ml 。

八、    體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：

九、    體內(nèi)實(shí)驗(yàn) ：

植瘤: 1×106的細(xì)胞數(shù)分別注射于兩只雄性，周齡和體重相似的裸鼠的背部皮下。

成像: 提前0.5h打開活體成像儀，把要拍攝的腫瘤部位周圍的鼠毛用8％Na2S脫去以使成像結(jié)果更清晰，然后給小鼠腹腔注射熒光素（luciferase的底物，每只注射3mg，稀釋于200ul生理鹽水中），等待10min使酶和底物充分反應(yīng)后將小鼠置于通有異氟烷氣體的麻醉箱內(nèi)麻醉，有必要可調(diào)整空氣與異氟烷氣體的流入量。小鼠*被麻醉后，關(guān)閉通入麻醉箱的麻醉氣體，打開通入成像儀暗箱的麻醉氣體通道，將小鼠放置于暗箱平臺(tái)中（小鼠頭應(yīng)嵌入異氟烷流入槽內(nèi)，防止其中途醒來影響成像結(jié)果）。di一次拍攝為有外加照明光源存在情況下的小鼠形體背景圖；第二次拍攝是無外加光源下拍攝的小鼠體內(nèi)發(fā)出的生物發(fā)光，Expose時(shí)間為6×105ms（可調(diào)節(jié)），第二次生物發(fā)光的圖像與di一次背景圖疊加后可清晰地觀察到小鼠發(fā)出生物發(fā)光的位置，熒光強(qiáng)弱。*用軟件計(jì)算出光源區(qū)域的單位光子數(shù)，獲取和整理圖像和處理數(shù)據(jù)。