中文名稱：SW116-LUC人大腸癌熒光素酶標(biāo)記細(xì)胞 培養(yǎng)步驟
規(guī)格：T25
形態(tài)特征：
生長(zhǎng)狀態(tài)：成纖維細(xì)胞樣
特征特性：貼壁生長(zhǎng)
培養(yǎng)條件：DMEM(高糖）+10%FBS（推薦BI優(yōu)等胎牛血清貨號(hào)：04-001-1acs）
傳代方法：消化3-5分鐘。1:2。3天內(nèi)可長(zhǎng)滿。
凍存條件無血清凍存液規(guī)格：100ML
支原體檢測(cè)：陰性
使用權(quán)限：A類
參考文獻(xiàn)：
供應(yīng)商：上海琛藝實(shí)業(yè)有限公司
復(fù)蘇周期：10個(gè)工作日左右
 
培養(yǎng)步驟：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL*培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
 
1、對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2. 加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的*培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打細(xì)胞，*脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4. 按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
PS：若客戶收到2ml小管細(xì)胞，收到細(xì)胞后，用75%酒精噴灑整個(gè)管子消毒后放到超凈臺(tái)或安全柜內(nèi)，嚴(yán)格無菌操作；將小管細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶或6cm培養(yǎng)皿，加入5ml左右*培養(yǎng)基混勻，放入培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后查看細(xì)胞密度：若密度未超過80%，換液繼續(xù)培養(yǎng)，視情況傳代或者凍存。若密度超過80%，可直接進(jìn)行傳代（方法同上）。

SW116-LUC人大腸癌熒光素酶標(biāo)記細(xì)胞 培養(yǎng)步驟

三、    母細(xì)胞來源  ATCC

四、    轉(zhuǎn)染方法與標(biāo)記過程的描述 慢病毒轉(zhuǎn)染 

(一)     質(zhì)粒部分

pLVX-luc慢病毒穿梭質(zhì)粒由本公司構(gòu)建并保存。 

(二)     慢病毒包裝部分

1. 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天， 293T在10cm培養(yǎng)盤中的細(xì)胞達(dá)到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養(yǎng)盤中。轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞在培養(yǎng)盤中密度達(dá)到80％。采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質(zhì)粒VSV G, Packaging Mix以及構(gòu)建的pLVX-luc質(zhì)粒15μg共轉(zhuǎn)染。6h后換新鮮DMEM培養(yǎng)基。 

2．提取病毒上清：轉(zhuǎn)染48-72hours后，將含有病毒液的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細(xì)胞碎片。 

3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于200μl離心管中，-80℃保存。 

(三)     慢病毒感染&篩選

1.感染前一天，消化HCT-116細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞鋪于6孔板中（以便在感染前細(xì)胞達(dá)到20%-40%的匯合度，37°C過夜孵化細(xì)胞。

2.(Day1) 解凍低溫保存的慢病毒液，加病毒液（滴度為109）1μl加入細(xì)胞中，向每孔加入Polybrene達(dá)到終濃度8ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過夜。

3.(Day2)12小時(shí)后移去含有慢病毒的培養(yǎng)基，加入2000μl*培養(yǎng)基。

4.(Day4后)按照HCT116正常培養(yǎng)細(xì)胞方法培養(yǎng)。 

五、    培養(yǎng)條件 ：置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，用含10％胎牛血清（FBS;杭州四季青公司）和1％雙抗（100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml鏈霉素，碧云天公司）的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)（Hyclone公司），培養(yǎng)三天（密度大概80%）按照1：3的比例傳代。

【注意事項(xiàng)】該細(xì)胞比較好養(yǎng)，國(guó)產(chǎn)的血清和培養(yǎng)基即可。這個(gè)細(xì)胞比較容易消化，0.25%的胰酶，大概消化半分鐘就可以吹打下來了。 

六、    細(xì)胞傳代所需時(shí)間：3天/代 

   七、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：熒光值達(dá)到107

   皮下移植瘤: 5×106的細(xì)胞數(shù)注射于一只雄性裸鼠背部皮下1周后成像。熒光紙達(dá)到107

   尾靜脈注射肺轉(zhuǎn)移：5×106的細(xì)胞數(shù)注射于一只雄性裸鼠尾靜脈后4week后成像。熒光紙達(dá)到107
 

(二)     慢病毒包裝部分

1. 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天，293T在10cm培養(yǎng)盤中的細(xì)胞達(dá)到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養(yǎng)盤中。轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞在培養(yǎng)盤中密度達(dá)到80％。采用脂質(zhì)體PEI轉(zhuǎn)染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質(zhì)粒VSV G, Packaging Mix以及構(gòu)建的Gluc或Mluc質(zhì)粒15μg共轉(zhuǎn)染。6h后換新鮮DMEM培養(yǎng)基。

2．提取病毒上清：轉(zhuǎn)染48-72hours后，將含有病毒液的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細(xì)胞碎片。

3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500μl離心管中，-80℃保存。

(三)     慢病毒感染&篩選

1.感染前一天(Day1)，消化SMMC7721細(xì)胞并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞鋪于24孔板中（以便在感染前細(xì)胞達(dá)到30%-50%的匯合度），37°C過夜孵化細(xì)胞。

2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液，并且制備1：2病毒稀釋液200μl加入細(xì)胞中。

3.向每孔加入Polybrene達(dá)到終濃度6ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過夜。

4.(Day3)移去含有慢病毒的培養(yǎng)基，加入500μl*培養(yǎng)基。

5.(Day4)換液，加入300μg/ml  Hygromycin（Sigma）來選擇穩(wěn)定感染的細(xì)胞克隆。

6.(Day4－7），每24h換液，300μg/ml Hygromycin（Sigma）來選擇穩(wěn)定感染的細(xì)胞克隆。

維持培養(yǎng)。

7.(Day8－12）細(xì)胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤和10cm盤中100μg/ml Hygromycin維持培養(yǎng)。

8. SMMC7721-Gluc/Mluc細(xì)胞系鑒定: 取5×104細(xì)胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞與陰性，陽(yáng)性對(duì)照共同進(jìn)行單報(bào)告基因檢測(cè)。GFP和mCherry表達(dá)通過熒光顯微鏡觀察。

五、    培養(yǎng)條件 ：置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，用含10％胎牛血清（FBS;    Hyclone, Tauranga, New Zealand）和1％雙抗（100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml鏈霉素，Hyclone, Logan, UT, USA）的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)三天（密度大概80%）按照1：3的比例傳代。

六、    細(xì)胞傳代所需時(shí)間：3天/代 

七、    篩選標(biāo)記維持壓力和選擇壓力：Hygromycin 100ug/ml 和300ug/ml 。

八、    體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：

1. 7721-Gluc 和7721-Mluc熒光顯微鏡照片(100×)： 

2. 細(xì)胞裂解液的發(fā)光值，數(shù)據(jù)—化學(xué)發(fā)光儀(Berthold Lumat LB 9501)檢測(cè)。

九、    體內(nèi)試驗(yàn)：（2-5）×106皮下接種1-2周成瘤，2周可達(dá)4-5mm大 小