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2025年2月21日，清華大學(xué)機(jī)械工程系熊卓教授在國(guó)際材料研究頂級(jí)期刊《先進(jìn)材料》（Advanced Materials, IF = 27.6）在線發(fā)表了題為“基于工程化活體存儲(chǔ)微球的檔案文件系統(tǒng)用于隨機(jī)可訪問(wèn)的體內(nèi)DNA存儲(chǔ)"(Engineered Living Memory Microspheroid-Based Archival File System for Random Accessible In Vivo DNA Storage) 的重大科研成果。

本研究提出了一種創(chuàng)新的DNA數(shù)據(jù)存儲(chǔ)系統(tǒng), 該系統(tǒng)基于攜帶彩色熒光標(biāo)記的工程化活體存儲(chǔ)微球（Engineered Living Memory Microspheroids, 簡(jiǎn)稱ELMM），被研究人員形象地稱為“細(xì)菌彩珠硬盤(pán)"。研究人員將數(shù)據(jù)編碼為DNA序列并插入可表達(dá)eGFP或mCherry等熒光蛋白的質(zhì)粒中，隨后將其轉(zhuǎn)化至細(xì)菌內(nèi)部，再將這些細(xì)菌快速封裝于水凝膠微球中，即得 “細(xì)菌彩珠硬盤(pán)"，這些ELMM可在室溫干燥環(huán)境中長(zhǎng)期且安全保存。當(dāng)需要檢索數(shù)據(jù)時(shí), 研究人員使用熒光激活流式分選 (FACS) 方法, 根據(jù)熒光蛋白信號(hào)對(duì)ELMM進(jìn)行分選和細(xì)菌擴(kuò)增, 最后再對(duì)細(xì)菌進(jìn)行測(cè)序和解碼以恢復(fù)原始數(shù)據(jù)；未使用的細(xì)菌可重新制成ELMM，形成流程閉環(huán)。這一創(chuàng)新的DNA數(shù)據(jù)存儲(chǔ)系統(tǒng)，涵蓋了數(shù)據(jù)編碼與合成、特征設(shè)定、信息整合與保存、隨機(jī)訪問(wèn)、復(fù)制、讀取與解碼等完整流程。

圖1  “細(xì)菌彩珠硬盤(pán)"DNA數(shù)據(jù)存儲(chǔ)系統(tǒng)工作流程示意圖

該研究的核心內(nèi)容為制備“細(xì)菌彩珠硬盤(pán)"和驗(yàn)證熒光激活分選方法的高效檢索能力。研究人員選取了不同的圖像數(shù)據(jù)編碼為DNA序列, 最終制備為直徑47.03μm的ELMM，并進(jìn)行了3個(gè)月室溫干燥保存和多達(dá)7次的凍干-復(fù)水循環(huán)測(cè)試, 驗(yàn)證其長(zhǎng)期穩(wěn)定和可重用性。而在數(shù)據(jù)檢索環(huán)節(jié)，研究人員設(shè)計(jì)了基于eGFP/mCherry/TagBFP等熒光蛋白信號(hào)的布爾邏輯檢索測(cè)試，并采用配備150 µm噴嘴的Bigfoot全光譜流式細(xì)胞分選儀對(duì)直徑近50μm的ELMM進(jìn)行熒光激活流式分選。通過(guò)對(duì)分選后細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)和DNA測(cè)序, 結(jié)果表明分選準(zhǔn)確率>98%，分選靈敏度可達(dá)0.1%; 即使在目標(biāo)數(shù)據(jù)僅10個(gè)拷貝的情況下, 數(shù)據(jù)也能被準(zhǔn)確檢索（見(jiàn)圖2）。

圖2 “細(xì)菌彩珠硬盤(pán)"支持多種文件類型 （多色熒光）和布爾邏輯的數(shù)據(jù)檢索

2025年1月3日，清華大學(xué)生命學(xué)院鄧海騰課題組在《衰老細(xì)胞》（Aging Cell）期刊上發(fā)表了題為“Tgm2催化IκBα共價(jià)交聯(lián)驅(qū)動(dòng)NF-κB核轉(zhuǎn)位增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型" (Tgm2-catalyzed covalent crosslinking of IκBα drives NF-κB nuclear translocation to promote SASP in senescent microglia) 的研究論文。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 2 (Tgm2) 在衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞中催化核因子 κB 抑制蛋白 α (IκBα) 的共價(jià)交聯(lián)形成二聚體，從而驅(qū)動(dòng)核因子 κB (NF-κB) 的核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而促進(jìn)衰老相關(guān)分泌表型 (SASP) 這一分子機(jī)制，并討論了對(duì)Tgm2靶向干預(yù)在改善SASP中的潛在應(yīng)用。

1. 老年 (22 mo) C57/B6小鼠, 藥物處理獲得BV2衰老細(xì)胞模型, 構(gòu)建Tgm2敲低BV2細(xì)胞系；

2. Western Blot, 免疫組織化學(xué)成像 (IHC) 和定量蛋白質(zhì)組學(xué) (TMT標(biāo)記) 分析衰老BV2細(xì)胞系/老年小鼠腦組織Tgm2蛋白表達(dá)；

3. 熒光激活流式細(xì)胞分選: 基于CD11b, IBA1/AIF-1, 和SPiDER-βGal染色從老年小鼠腦組織中分選獲得衰老的原代小膠質(zhì)細(xì)胞，使用儀器為Bigfoot光譜流式分選儀。分選后的原代小膠質(zhì)細(xì)胞具有高純度, 并可體外培養(yǎng)3周，用于TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

4. Western Blot, 免疫熒光成像 (IF), RT-qPCR等手段鑒定衰老細(xì)胞NF-κB通路相關(guān)蛋白或SASP因子表達(dá)變化及核轉(zhuǎn)位；

5. 基于非變性Western Blot和蛋白質(zhì)譜分析鑒定由 Tgm2催化的IκBα二聚體交聯(lián)位點(diǎn)；

6. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用行為學(xué)測(cè)試 (轉(zhuǎn)棒、Y迷宮等) 評(píng)估Tgm2抑制劑 (Cys-D) 處理后的體內(nèi)效果。

圖3 老年小鼠腦組織分選原代小膠質(zhì)細(xì)胞及獲得衰老細(xì)胞工作流程圖。

圖右: 流式分選結(jié)果示例圖。

本研究中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Tgm2蛋白在衰老小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá), 且表達(dá)水平在衰老BV2細(xì)胞系中也顯著上升。Tgm2在衰老細(xì)胞中形成正反饋循環(huán)通路: Tgm2-NF-κB-SASP, 加速細(xì)胞衰老。其核心在于上調(diào)的Tgm2通過(guò)催化 IκBα蛋白形成共價(jià)交聯(lián)二聚體，激活NF-κB核轉(zhuǎn)位, 促進(jìn)SAPS表型而進(jìn)一步上調(diào)Tgm2表達(dá)。以Tgm2為靶向策略, Cys-D等Tgm2抑制劑的干預(yù)可減少NF-κB核轉(zhuǎn)位，降低SASP水平; 且老年小鼠經(jīng)口服Cys-D處理后可顯著改善老年小鼠的衰老表型。這一研究成果顯示出Tgm2有望成為延緩衰老的重要指標(biāo)，靶向干預(yù)Tgm2在防治衰老相關(guān)疾病中具備潛在的應(yīng)用價(jià)值。

2025年2月25日，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所）、 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所、國(guó)家生物信息中心等團(tuán)隊(duì)合作在Cell Reports雜志發(fā)表封面文章“RNA m5C Methylation Mediated by Ybx1 Ensures Hematopoietic Stem and Progenitor Cell Expansion", 揭示造血發(fā)育過(guò)程中RNA m⁵C修飾的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)RNA結(jié)合蛋白Ybx1通過(guò)識(shí)別m⁵C修飾位點(diǎn)，穩(wěn)定細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄本，促進(jìn)HSPC增殖。

1. 細(xì)胞與動(dòng)物模型: 野生型和轉(zhuǎn)基因系斑馬魚(yú) (CD41:GFP, runx1:en-GFP, kdrl: mCherry, cmyb:EGFP) 和C57BL/6小鼠胚肝HSPC；

2. 熒光激活流式細(xì)胞分析/分選: 分選轉(zhuǎn)基因系斑馬魚(yú)不同發(fā)育階段HSPC (CD41:GFPlow 或runx1: en-GFP+), GFP+ HSPC比例分析, 細(xì)胞周期檢測(cè) (PI染色); 分選C57BL/6小鼠胎肝LSK (FITC-Lineage-, APC-c-Kit+, PE-Cy7-Sca-1+)  HSPCs和Ki-67細(xì)胞增殖檢測(cè)。其中Bigfoot超高速流式細(xì)胞分選儀主要用于小鼠胎肝LSK HSPC分選；

3. 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 (RNA-Seq) 與RNA重亞硫酸鹽測(cè)序 (RNA-BisSeq)：分析斑馬魚(yú)模型HSPCs在不同發(fā)育階段的RNA m5C修飾動(dòng)態(tài)及轉(zhuǎn)錄組變化；

4. RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn) (RIP-seq, RIP-qPCR, m5C RIP-qPCR): 鑒定和驗(yàn)證HSPCs中Ybx1結(jié)合靶標(biāo)和m5C修飾轉(zhuǎn)錄本；

5. 共聚焦顯微和原位雜交成像: 共聚焦顯微成像用于斑馬魚(yú)胚胎TUNEL, BrdU, EdU和pHH3免疫熒光, 及斑馬魚(yú)胚胎延時(shí)成像; 整胚原位雜交 (WISH) 和雙熒光原位雜交 (dFISH) 用于檢測(cè)HSPC標(biāo)志物, 細(xì)胞周期指標(biāo)和m5C相關(guān)基因(ybx1等) 表達(dá)；

6. 熒光定量PCR (qPCR) 和液相色譜-質(zhì)譜分析 (UHPLC-MS/MS): 分別用于mRNA穩(wěn)定性分析/m5C報(bào)告系統(tǒng)和RNA m5C定量檢測(cè)；

7. 細(xì)胞和動(dòng)物功能實(shí)驗(yàn): 斑馬魚(yú)胚胎移植、異種共生、TET抑制劑處理, 小鼠HSPC siRNA基因干擾。

本研究首先對(duì)斑馬魚(yú)模型進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 (RNA-Seq) 和RNA m⁵C甲基化測(cè)序 (RNA-BisSeq), 描繪了HSPC發(fā)育過(guò)程中RNA m⁵C修飾的動(dòng)態(tài)變化, 并通過(guò)RNA-蛋白相互作用、基因缺失和回補(bǔ)等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn): RNA結(jié)合蛋白Ybx1可識(shí)別細(xì)胞周期相關(guān)基因 (如cyclin d1和mcm6) 的mRNA m⁵C修飾位點(diǎn), 增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性和表達(dá)水平, 進(jìn)而促進(jìn)HSPCs增殖。本研究進(jìn)一步使用Bigfoot超高速流式細(xì)胞分選儀, 從小鼠胎肝中分選出HSPCs并進(jìn)行ybx1基因敲低。結(jié)果表明ybx1表達(dá)缺失會(huì)抑制小鼠HSPCs的集落形成和體內(nèi)增殖。這一結(jié)果證明了在斑馬魚(yú)和小鼠等物種內(nèi), 由Ybx1介導(dǎo)的RNA m⁵C表觀遺傳調(diào)控機(jī)制在造血系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

圖4 小鼠胎肝HSPC流式細(xì)胞分選，用于ybx1基因功能驗(yàn)證