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						上海源葉生物科技有限公司
            中級(jí)會(huì)員 | 第15年
            
					
            
				
            
			
            
		
            
	
            
	
	
            
		
            
			
		
            
	
            

            

	
            
		
            
			
			
            
							
            
					
            葡萄球菌A蛋白（SPA）在免疫組化中的應(yīng)用2012/07/14
            
					
            
				SPA可為多種示蹤物（如熒光素、酶、膠體金、鐵蛋白）所標(biāo)記，應(yīng)用較廣泛的為酶標(biāo)記SPA和金標(biāo)記SPA技術(shù)。標(biāo)記SPA常用的酶為HRP，可應(yīng)用于間接法染色，SPA在PAP法中可代替橋抗體。1．SPA—HRP在間接法中的應(yīng)用由于SPA能結(jié)合IgG的Fc段，因此就成為天然的抗IgG，酶標(biāo)記的SPA可代替酶標(biāo)記的IgG抗血清，從而測(cè)定和定位組織內(nèi)的IgG或免疫復(fù)合物，SPA—HRP的染色步驟如下。（1）石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。（2）3％H202處理15min，以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶（3）TBS洗3X3mi
					
            
				
            
								
            
					
            感受態(tài)細(xì)胞的制備及溶液配制2012/07/07
            
					
            
				1.挑取適當(dāng)菌株的E.coli單菌落接種于2mlSOB培養(yǎng)液中，37℃搖床過(guò)夜。2.取0.5-1ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)種到50mlSOB中，18℃劇烈震蕩，直到A600達(dá)到0.6。3.將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，4℃4,000rpm/min離心10min。同時(shí)在冰浴上配置TB溶液。4.棄上清，將離心管倒置于濾紙上，使培養(yǎng)液被吸干。5.取1ml剛配的TB溶液打散菌體沉淀，再加入15mlTB（1/3體積的起始培養(yǎng)液），冰浴10-15min，4℃4,000rpm/min離心10min。6.棄上清，沉
					
            
				
            
								
            
					
            感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)流程2012/07/07
            
					
            
				1.取100μl感受態(tài)細(xì)胞于冰浴上融化。2.加入1μl純質(zhì)粒或連接產(chǎn)物，輕輕吹打混勻，冰浴30min。3.將菌液放入42℃水浴中熱激90秒，立即放入冰浴中2min。4.加入0.9mlSOC，于37℃恒溫?fù)u床上200rpm×1hr溫育。5.將菌液4000rpm/min離心3min，留200μl上清將菌體打散，均勻涂布于含適當(dāng)抗生素的瓊脂平板表面，平板于37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。注：①新倒的平板可于37℃培養(yǎng)箱中預(yù)先放置數(shù)小時(shí)至過(guò)夜干燥。②當(dāng)轉(zhuǎn)化的是TA克隆連接產(chǎn)物時(shí)可在菌液中加入8μl1MIPTG和40
					
            
				
            
								
            
					
            適應(yīng)性免疫涉及的一些重要概念2012/06/30
            
					
            
				1．三個(gè)特點(diǎn)（1）特異性：二次應(yīng)答時(shí)能精細(xì)地區(qū)分致敏的抗原和其他無(wú)關(guān)的抗原；因而免疫應(yīng)答的特異性指的是抗原特異性（2）多樣性：參與獲得性免疫應(yīng)答的淋巴細(xì)胞，其表面識(shí)別結(jié)構(gòu)和相應(yīng)分子（如抗體）所顯示的高度異質(zhì)性，賦予機(jī)體具有識(shí)別數(shù)量極大的抗原并與之起反應(yīng)的能力。多樣性是特異性產(chǎn)生的基礎(chǔ)。（3）記憶性：再次遇到同一抗原時(shí)，出現(xiàn)增強(qiáng)性應(yīng)答。免疫記憶由記憶性淋巴細(xì)胞承擔(dān)。2．應(yīng)答類型（1）體液免疫和細(xì)胞免疫：由抗體一類可溶性分子介導(dǎo)的免疫應(yīng)答稱為體液免疫；由免疫細(xì)胞主要是T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答稱為細(xì)胞免疫
					
            
				
            
								
            
					
            固有免疫中的細(xì)胞和分子與適應(yīng)性免疫應(yīng)答2012/06/30
            
					
            
				（1）參與固有免疫的細(xì)胞和分子為T細(xì)胞的激活提呈抗原：DC和Mop屬專職APC，在T細(xì)胞激活中的關(guān)鍵作用包括兩方面：提呈抗原和提供協(xié)同刺激信號(hào)。為此，要求兩類細(xì)胞能有效地表達(dá)MHC分子和協(xié)同刺激分子。這種表達(dá)，可以是組成性的，也可以是誘導(dǎo)性的。（2）參與固有免疫的細(xì)胞和分子為T細(xì)胞亞群的分化提供指令性信息：例如，DC及其分泌的IL-12能對(duì)T細(xì)胞的功能性分化（ThO向Thl分化）提供指令性信息。另外，NKT細(xì)胞等分泌的IL-4有利于Th2的分化。（3）參與固有免疫的細(xì)胞和分子在適應(yīng)性免疫中發(fā)揮效
					
            
				
            
								
            
					
            GWAS發(fā)現(xiàn)偏頭疼相關(guān)新基因2012/06/16
            
					
            
				理論認(rèn)為腦神經(jīng)元間信號(hào)傳遞的重要分子的調(diào)節(jié)異常是引發(fā)偏頭疼的因素，而此次研究中發(fā)現(xiàn)的新基因進(jìn)一步為該理論提供了證據(jù)。此前有研究認(rèn)為血管及血流故障在引發(fā)偏頭疼中可能有重要作用，而此次研究發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)新基因?yàn)檫@一觀點(diǎn)提供了支持。研究人員將4800位偏頭疼患者的基因組與超過(guò)7000份正常基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行了比對(duì)，通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析GWAS對(duì)那些會(huì)提高患者偏頭疼敏感性的基因組突變進(jìn)行了研究。這是人類普通偏頭疼相關(guān)基因的第三次報(bào)道，同時(shí)也是針對(duì)zui普遍偏頭疼亞型的研究報(bào)道。該研究成功的基礎(chǔ)在于，集合了大量相
					
            
				
            
								
            
					
            抗體片段及其衍生形式2012/06/09
            
					
            
				1．雙特異性抗體將兩套輕鏈、重鏈基因?qū)牍撬枇黾?xì)胞中，選擇合適的抗體恒定區(qū)及Ig類型，可獲得產(chǎn)量大、均一性和高純度的雙特異性抗體。另外，以化學(xué)交聯(lián)技術(shù)或雜交—雜交瘤技術(shù)也可獲得雙特異性抗體。2．Fab抗體Fab抗體是由重鏈Fd（即VM+CHl）和完整輕鏈通過(guò)二硫鍵結(jié)合而成的異二聚體，僅含一個(gè)抗原結(jié)合部位。將重鏈Fd和完整輕鏈的編碼基因連接，5，端融合細(xì)菌蛋白信號(hào)肽基因可在大腸桿菌內(nèi)分泌型表達(dá)，形成完整的立體折疊和鏈內(nèi)、鏈間二硫鍵，保持Fab片段的功能。3．Fv抗體其制備原理是：分別構(gòu)建含VH和V
					
            
				
            
								
            
					
            主要組織相容性復(fù)合體2012/06/09
            
					
            
				主要組織相容性復(fù)合體（MHC）是由一組高度多態(tài)性基因組成的染色體區(qū)域。MHC基因產(chǎn)物能在不同細(xì)胞表面表達(dá)，通常稱之為MHC分子或MHC抗原，又因這些抗原在器官移植中代表供受者雙方的組織相容程度，也稱為移植抗原或組織相容性抗原。脊椎動(dòng)物中，從魚到人類都存在結(jié)構(gòu)與功能相似的MHC遺傳區(qū)域，如小鼠的MHC是H-2，堵的MHC是SLA，人的MHC是HLA。MHC是現(xiàn)知多態(tài)性zui為豐富的一個(gè)基因系統(tǒng)，擁有大量的等位基因，賦予種群巨大潛力以適應(yīng)多變的內(nèi)外環(huán)境。MHC分子不但在T細(xì)胞分化發(fā)育中是必需的，而且
					
            
				
            
								
            
					
            吸光和發(fā)光組織樣品的常用測(cè)量參數(shù)2012/06/04
            
					
            
				像素是顯微圖像分析系統(tǒng)的zui小測(cè)量單位，通過(guò)它我們不僅能夠得到待測(cè)范圍內(nèi)的幾何形態(tài)信息，如面積、周長(zhǎng)和直徑等等，還可根據(jù)樣品是否能夠吸光或發(fā)光來(lái)測(cè)量其物質(zhì)的總含量。在組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)中常用熒光素來(lái)標(biāo)記物質(zhì)，使被測(cè)量物質(zhì)產(chǎn)生有色熒光，從而進(jìn)行分析。此外，在原位雜交技術(shù)中，采用放射自顯影的標(biāo)本也可以作為發(fā)光組織細(xì)胞樣品使用顯微圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。（一）眼光組織細(xì)胞樣品的測(cè)量對(duì)于吸光組織細(xì)胞樣品，圖像分析系統(tǒng)至少能以下列三種參數(shù)來(lái)表述細(xì)胞待測(cè)物質(zhì)的計(jì)量結(jié)果：1．積分光密度（integrate
					
            
				
            
								
            
					
            酶免疫電泳技術(shù)2012/06/02
            
					
            
				一，酶免疫電泳技術(shù)的原理抗原與抗體在瓊脂糖凝膠中電泳時(shí)，在堿性緩沖液的條件下，抗原帶負(fù)電，向正極移動(dòng)。不同分子量或還不同電荷的抗原，在相同條件下，移動(dòng)距離不等。這些在不同部位的抗原，再與相關(guān)抗體經(jīng)擴(kuò)散形成免疫沉淀線。酶免疫電泳技術(shù)中的抗原與抗體就是酶和它的相應(yīng)抗體球蛋白。酶抗原與酶抗體形成的免疫復(fù)合物是用底物顯色的，由于酶反應(yīng)的高度靈敏性，使酶免疫電泳技術(shù)成為一項(xiàng)靈敏度高的檢測(cè)技術(shù)，但僅局限于酶蛋白的分析鑒定。二，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）免疫電泳技術(shù)的程序1，器材與設(shè)備電泳儀（包括電泳槽）；溫箱
					
            
				
            
								
            
					
            活細(xì)胞間接免疫熒光法2012/06/02
            
					
            
				一．實(shí)驗(yàn)器材：1．器材：40孔塑料板、40孔板離心機(jī)、微量加樣器、振蕩器、蓋玻片、熒光顯微鏡等。2．試劑：?jiǎn)慰孤】贵w（單抗）、熒光標(biāo)記抗鼠免疫球蛋白、PBS（pH7.2-7.4）、甘油、疊氮鈉（NaN3）等。二．方法（微量法）1．將分離好的單個(gè)核細(xì)胞用PBS洗2次，1000rpm每次10分鐘。用含0.1%NaN3PBS調(diào)細(xì)胞濃度在0.5-1×108/ml（5000萬(wàn)-1億/ml），加在40孔板上，每孔10ul，含5-10×105細(xì)胞，然后加入單抗（*抗體）50ul（同時(shí)加入AB型血清5ul）振蕩
					
            
				
            
								
            
					
            DNA合成儀的發(fā)展2012/05/19
            
					
            
				當(dāng)前DNA合成儀的主要生產(chǎn)廠商都致力于機(jī)器性能的完善和應(yīng)用領(lǐng)域的開(kāi)拓以及率、高產(chǎn)率的儀器的開(kāi)發(fā)與研究。中國(guó)臺(tái)灣科學(xué)委員會(huì)“基因醫(yī)藥衛(wèi)生科技研究計(jì)劃”中的基因生物技術(shù)組已經(jīng)成功研發(fā)**臺(tái)高密度復(fù)制DNA合成儀，可以同時(shí)合成384條不同DNA，每日可合成768條DNA，并可以配合聚合酶連鎖反應(yīng)裝置，大量復(fù)制各種基因，不但節(jié)省時(shí)間，也可節(jié)省大量人力，這部機(jī)器能復(fù)制動(dòng)物、人體、植物的基因甚至是防偽基因。由于人們所需要的大部分核酸的堿基對(duì)數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)目前DNA合成儀可以合成的zui長(zhǎng)核酸鏈的堿基對(duì)數(shù)量，因
					
            
				
            
								
            
					
            多肽合成的基本原理2012/05/19
            
					
            
				多肽合成是一個(gè)重復(fù)添加氨基酸的過(guò)程，合成一般從C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。過(guò)去，多肽合成是在溶液中進(jìn)行，現(xiàn)在多采用固相合成法從而大大地減輕了每步產(chǎn)品提純的難度。為防止副反應(yīng)的發(fā)生，合成柱與添加的氨基酸的側(cè)鏈都被保護(hù)，羧基端是游離的，且在反應(yīng)之前必須活化?；瘜W(xué)合成方法有兩種，即Fmoc法和Boc法。由于Fmoc比Boc有很多優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)在大多采用Fmoc法合成。甲基化聚苯乙烯樹(shù)脂，目前，廣泛采用比氯甲基樹(shù)脂更加穩(wěn)定的對(duì)乙酰氨基芐酯（PAM）樹(shù)脂。合成肽酰胺時(shí)采用二苯甲胺型樹(shù)脂。Boc保護(hù)。—氨
					
            
				
            
								
            
					
            特異性循環(huán)免疫復(fù)合物的測(cè)定2012/05/12
            
					
            
				特異性CIC分為單特異性CIC和雙特異性CIC兩類。前者適用于檢測(cè)已知抗原及其相應(yīng)抗體組成的CIC。雙特異性CIC是指對(duì)組成CIC的抗原、抗體和補(bǔ)體中某兩種成分組合明確的CIC，常采用的檢測(cè)方法為ELISA和RIA技術(shù)，需要兩種特異性各異的抗體。因此，檢測(cè)要求條件較高，但能較全面地反映CIC的病理意義。在檢測(cè)雙特異性CIC時(shí)，由于要求有兩種特異性抗體，每種抗體均可用作包被或檢測(cè)抗體，故具體到檢測(cè)某類雙特異性CIC時(shí)，根據(jù)兩種抗體的不同，可使用兩種方法。以ELISA法為例，如檢測(cè)HBsAg／IgC
					
            
				
            
								
            
					
            胰蛋白酶解離法檢測(cè)HBsAg-CIC2012/05/12
            
					
            
				用3．5％PEG選擇性地沉淀血清中CIC，繼之用胰蛋白酶消化沉淀物中的抗體蛋白，分離出抗原部分，用反向間接血凝法測(cè)定HBsAg滴度。與不加胰蛋白酶的對(duì)照管比較，如HBsAg滴度升高，則說(shuō)明有HBsAg-CIC的存在。1．試劑①pH8．4硼酸鹽緩沖液（BBS）：配制法同*節(jié)中PEG沉淀試驗(yàn)；②7％PEG及3．5％PEG溶液：用BBS配制；③10mg／mL胰蛋白酶溶液：用pH8．2巴比妥緩沖液配制。2．操作步驟（1）在測(cè)定管與對(duì)照管內(nèi)務(wù)加待測(cè)血清0．2mL。（2）兩管各加pH8．4BBSl．8mL，
					
            
				
            
								
            
					
            IL-16的檢測(cè)2012/05/05
            
					
            
				即以前的淋巴細(xì)胞趨化因子（1ymphocytechemoattractantfactor，LCF）。主要由CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，對(duì)T淋巴細(xì)胞特別是CD4+細(xì)胞具有選擇性趨化作用。（1）IL-16的誘生1）分離PBMC，調(diào)整細(xì)胞濃度為3X106／mL，加入平底培養(yǎng)板中，置37℃5％C02溫箱培養(yǎng)。2）加入血清素（serotonin，即5-羥色胺），使終濃度為10—4moL／L，培養(yǎng)24h，離心收獲上清用于IL-16活性檢測(cè)。（2）IL-16的測(cè)定：可根據(jù)IL-16對(duì)淋巴細(xì)胞的趨化作用測(cè)定其活性。
					
            
				
            
								
            
					
            IL-17的檢測(cè)2012/05/05
            
					
            
				IL-17是新近被確認(rèn)的一種細(xì)胞因子，由T細(xì)胞，主要是CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生，其靶細(xì)胞廣泛?？杉せ钷D(zhuǎn)錄因子NF-KB，誘導(dǎo)纖維母細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、ID8、GM-CSF、和膜性細(xì)胞間粘附分子1（1CAM-1），促進(jìn)由亞適劑量PHA所誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖。目前編碼IL-17及其受體的基因核苷酸序列已被部分測(cè)定。（1）IL-17的誘導(dǎo)：取人PBMC或純化的CD4+T細(xì)胞，加入誘導(dǎo)劑（PMA5ng／mL+ionomycin3ug／mL，或ConA63ug／mL，或抗CD28抗體+CD3抗體），37℃孵育48—7
					
            
				
            
								
            
					
            三條途徑對(duì)C3轉(zhuǎn)化酶的激活2012/04/21
            
					
            
				1．經(jīng)典途徑始于抗體（主要是IgM和I知）對(duì)病原體或細(xì)胞表面抗原分子的識(shí)別及抗原抗體復(fù)合物的形成。補(bǔ)體C1q分子結(jié)合抗體后觸發(fā)這一經(jīng)典途徑。C1q和Clr、Cls共同組成O復(fù)合物（圖7d3A），Clr和Os隨著Clq的活化而依次激活。Cls活化后專一性地使下列兩個(gè)補(bǔ)體成分分解：出分解成FAa，和Ob；C2分解成C2a和C2l被激活的兩個(gè)大片段C4b和C2b迅速沉積到細(xì)胞表面，共同構(gòu)成經(jīng)典途徑中顯示酶解活性的C3轉(zhuǎn)化酶即C4b2b。補(bǔ)體Cl復(fù)合體及攻膜復(fù)合物形成過(guò)程示意圖2．凝集素途徑由甘露糖結(jié)合
					
            
				
            
								
            
					
            補(bǔ)體的效應(yīng)功能和補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的后期事件2012/04/21
            
					
            
				1．介導(dǎo)炎癥反應(yīng)斟、C3、C5分解產(chǎn)生的小片段CAa、C3a和C作為一種肽介導(dǎo)物（peptidemediator）參與誘導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)，起著招募吞噬細(xì)胞的作用。2．調(diào)理作用C3是血漿中濃度zui高的補(bǔ)體蛋白，含量為1．2mg／ml。一個(gè)C3轉(zhuǎn)化酶可以分解1000個(gè)C3分子，由此產(chǎn)生大量的C3b。C3b憑借其暴露出來(lái)的硫酯鍵，以共價(jià)形式結(jié)合于病原體表面，否則C3b將因水解而失活。因而補(bǔ)體激活的一個(gè)重要結(jié)果，是使C3b大量沉積和覆蓋在病原體或靶細(xì)胞的表面。另一方面，吞噬細(xì)胞帶有識(shí)別C3b的受體，有利
					
            
				
            
								
            
					
            吞噬防御屏障2012/04/14
            
					
            
				吞噬細(xì)胞攝入胞外物質(zhì)主要有兩種形式：胞吞和吞噬。（1）胞吞（endocytosis）：指胞外組織液中的大分子被細(xì)胞攝人。其方式又有兩種，分別稱為胞飲（扛nocytosis）和受體介導(dǎo)的胞吞（圖7—17）。前者直接吞人可溶性大分子；后者選擇性地吞人受體—大分子復(fù)合物。隨后，帶有大分子的胞吞小泡相互融合而進(jìn)入內(nèi)體（endosome）。內(nèi)體中的酸性內(nèi)含物使大分子和受體分子解離，后者可再循環(huán)至細(xì)胞表面，而帶有游離大分子的內(nèi)體則和來(lái)自高爾基體的初級(jí)溶酶體（1ysosome）融合成為次級(jí)溶酶體。溶酶體內(nèi)含有
					
            
				
            
							
				
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